Materi Isolasi DNA dan Elektroforesis

Materi Praktikum Isolasi DNA

Praktikum Biomolekul

Jurusan Kimia

1.1 Peremajaan isolat bakteri xilanolitik

Proses peremajaan bakteri dimulai dari mengambil biakan isolat dari kultur sebelumnya. Isolat diambil dengan menggunakan kawat ose. Lalu kawat yang mengandung biakan ini digoreskan pada media padat yang baru. Selanjutnya biakan diinkubasi pada oven dengan suhu 37⁰C selama 18 jam.

1.2  Isolasi plasmid pET30 dari E. coli  BL21

Koloni tunggal transforman E. Coli diinokulasi ke dalam 5 ml media Luria Bertani cair yang mengandung 2,5 µl kanamisin 100 mg/ml dan diinkubasi pada shaker incubator pada 37 °C dengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam. Setelah 18 jam, inokulum disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 °C.

Pellet dilarutkan dalam larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-HCl 2,5 mM pH 8, Na₂EDTA 10 mM pH 8) 100 µL dan dihomogenkan lalu didiamkan 5 menit. Ditambahkan 200 µL larutan II (NaOH 0,2 M, SDS 1%, ddH₂O steril) dan dihomogenkan dengan cara membolak-balik tabung Eppendorf. Larutan diinkubasi di es selama 15 menit, setelah 15 menit ditambahkan 150 µL larutan III (Kalium asetat 5 M, asam asetat glasial, ddH₂O dingin), diinkubasi dalam es selama 10 menit. Campuran tersebut disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12.000 rpm suhu 4 °C, supernatan yang diperoleh dipindahkan secara perlahan dengan menggunakan pipet kedalam tabung Eppendorf baru yang steril dan ditambahkan campuran fenol: kloroform: isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi 12.000 rpm 2 menit dan dihasilkan 3 lapis, fase paling atas adalah fase cair yang dipindahkan dengan cara memipet secara hati-hati kedalam tabung Eppendrorf baru yang steril, fase cair tersebut dipekatkan dengan menambahkan etanol absolut dingin 2 kali volume total, dan diinkubasi dalam es selama 1 jam. Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, pellet dicuci dengan etanol dingin 70% dan disentrifugasi lagi dan tabung Eppendorf dikeringkan dari etanol dengan cara membalikkan tabung dan didiamkan 5 menit. Kemudian pellet dilarutkan dalam 30 µL ddH₂O (Sambrook dan Russel, 2001).

1.3  Analisa pET-Endo menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa

Gel agarosa 1,5% dibuat dengan melarutkan 0,375 g agarosa dalam 25 ml buffer TAE (Tris Acetat EDTA) pH 8. Agarosa yang sudah larut didinginkan sampai kira-kira temperatur 45°C, selanjutnya gel dituangkan pada cetakan dan dibiarkan memadat. Sampel yang akan dielektrolisis dicampur dengan buffer yang mengandung bromofenol biru (BPB) 0,25 (b/v) dan sukrosa 40 % (b/v). Elektrolisis dilakukan dalam buffer TAE pada tegangan 75 volt. Elektrolisis dihentikan ketika bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel. Gel agarosa kemudian direndam dalam larutan Etidium Bromida (EtBr) 250 µg/mL selama 30 menit, selanjutnya direndam dalam buffer TAE selama 5-10 menit. Hasil elektroforesis dapat diamati dengan sinar UV (Sambrook dan Russel, 2001).

1.4  Isolasi DNA kromosom isolat

Koloni tunggal isolat  diinokulasikan ke dalam 5 ml media cair dan diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 37⁰C dengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam. Kemudian sebanyak 5 ml suspensi sel disentrifuge selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4^oC. Setelah terpisah, supernatan dibuang,

 kemudian pellet sel diresuspensi dengan 250 µl buffer TE (50 mM tris HCl pH 8 dan 50 mM EDTA). Larutan tersebut dibekukan pada suhu -20^oC selama 30 menit. kemudian ditambahan 250 µL lisozim 10mg/ml ke dalam sel beku dan dibiarkan mencair pada suhu kamar. Larutan sel yang sudah mencair dimasukkan ke dalam penangas es selama 45 menit. Lalu menambahkan larutan STEP (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase K) sebanyak 50µL ke dalam suspensi dan dicampur rata. Campuran ini selanjutnya dipanaskan dalam waterbath pada suhu 50^oC selama 1 jam sambil sesekali digoyang perlahan. Kemudian ditambahkan 300µL  larutan fenol jenuh ke dalam campuran lalu dikocok sampai terbentuk emulsi. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 12.000rpm selama 5 menit sampai terpisah dua lapisan. DNA yang diinginkan berada pada lapisan atas. Lapisan atas dipipet secara hati-hati dan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf yang steril. Selanjutnya ditambahkan larutan natrium asetat 0,3 M sebanyak 0,1 kali dari volume total hasil pemipetan DNA, lalu dicampur perlahan. Kemudian ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan kemudian tabung dibolak-balik untuk pencampuran. Setelah itu, campuran diinkubasi pada suhu -20^oC selama 2 jam sampai semalam. Campuran disentifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit, kemudian supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 0,6 ml etanol 70%. Sentrifuge kembali campuran pada 12000 rpm selama 5 menit. Pelet diambil kemudian ditambahkan 30 µL ddH₂0